四款细胞支原体污染用快速支原体检测试剂盒

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上海易色医疗科技有限公司提供四款体外培养细胞支原体污染用《快速支原体检测试剂盒和支原体检测方法》，分别是：《一步法恒温支原体检测试剂盒》、《PCR法支原体检测试剂盒》、《发光法支原体检测试剂盒》和《探针法支原体检测试剂盒》。还介绍了细胞支原体污染的图片、表现、危害、症状、来源、途径、怎么办和如何处理的方法。

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四 款 细 胞 支 原 体 污 染 用 快 速 支 原 体 检 测 试 剂 盒   ​ 上 海 易 色 医 疗 科 技 有 限 公 司 S h a n g h a i Y i s e M e d i c a l T e c h n o l o g y C o . , L t d . 上 海 易 色 — — 支 原 体 检 测 专 家 ！ 首 页 公 司 简 介 上 市 产 品 产 品 价 格 下 载 中 心 联 系 我 们 本 公 司 招 牌 产 品 【 四 款 细 胞 培 养 用 快 速 《 支 原 体 检 测 试 剂 盒 》 （ 点 击 进 入 ） 】 之 一 细 胞 《 一 步 法 恒 温 支 原 体 检 测 试 剂 盒 》 详 细 介 绍 ​   一 、 《 一 步 法 恒 温 支 原 体 检 测 试 剂 盒 》 主 要 用 途 ​ ​ 《 一 步 法 恒 温 支 原 体 检 ​ 测 试 剂 盒 》 主 要 用 于 检 测 细 胞 培 养 上 清 或 别 的 液 体 样 品 中 是 否 含 有 支 原 体 污 染 ， 该 试 剂 盒 仅 用 于 基 础 科 研 。   二 、 《 一 步 法 恒 温 支 原 体 检 测 试 剂 盒 》 扩 增 原 理 ​ ​ 《 一 步 法 恒 温 支 原 体 检 测 试 剂 盒 》 采 用 独 特 的 恒 温 基 因 扩 增 技 术 和 显 色 技 术 ， 对 样 品 的 支 原 体 基 因 组 D N A 进 行 恒 温 扩 增 ， 反 应 完 后 ， 通 过 反 应 管 的 颜 色 即 可 对 结 果 进 行 判 断 。   ​ ​   三 、 《 一 步 法 恒 温 支 原 体 检 测 试 剂 盒 》 八 大 优 点 ​ ​ 《 一 步 法 恒 温 支 原 体 检 测 试 剂 盒 》 八 大 优 点   ​ （ 1 ）   极 端 方 便 ， 整 个 检 测 过 程 只 需 一 步 即 可 完 成 。 （ 2 ）   极 端 省 时 ， 整 个 检 测 过 程 只 需 1 小 时 ， 而 P C R 法 通 常 需 要 2 3 小 时 。 （ 3 ） 灵 敏 度 良 好 ， 一 般 比 3 0 个 循 环 普 通 P C R 灵 敏 度 高 。 （ 4 ） 无 需 样 品 的 前 处 理 。 由 于 细 胞 培 养 数 天 后 ， 培 养 液 中 经 常 含 有 严 重 抑 制 P C R 扩 增 的 代 谢 物 ， 所 以 样 品 的 前 处 理 一 般 是 P C R 法 不 可 或 缺 的 环 节 。 而 R D R C A 扩 增 不 受 抑 制 ， 无 需 样 品 的 前 处 理 。 （ 5 ） 无 需 样 品 的 离 心 浓 缩 ， 检 测 只 需 1 微 升 培 养 液 即 可 。 （ 6 ） 无 需 用 到 P C R 仪 、 电 泳 槽 、 凝 胶 成 像 仪 、 离 心 机 等 仪 器 ， 整 个 检 测 只 需 一 个 水 浴 锅 即 可 完 成 。 （ 7 ） 无 需 电 泳 ， 无 需 接 触 E B 等 诱 癌 物 质 。 根 据 反 应 管 的 指 示 剂 ， 肉 眼 即 可 判 断 反 应 结 果 。 （ 8 ） 产 品 稳 定 性 极 好 ， 冻 干 型 产 品 可 以 在 室 温 至 少 放 置 2 个 月 ， 2 0 ℃ 至 少 可 以 放 置 2 年 。   四 、 《 一 步 法 恒 温 支 原 体 检 测 试 剂 盒 》 法 与 P C R 法 的 灵 敏 度 和 抗 干 扰 性 比 较 ​ ​ ​   将 有 支 原 体 污 染 的 细 胞 培 养 液 上 清 用 水 做 系 列 稀 释 （ R D R C A 做 1 0 倍 系 列 稀 释 、 P C R 做 5 倍 系 列 稀 释 ） ， 而 后 分 别 用 《 一 步 法 恒 温 支 原 体 检 测 试 剂 盒 》 和 普 通 P C R 进 行 支 原 体 检 测 。       ​ 如 右 图 所 示 ， 采 用 R D R C A 法 的 《 一 步 法 恒 温 支 原 体 检 测 试 剂 盒 》 在 稀 释 1 0 0 0 0 倍 后 仍 呈 明 显 的 阳 性 而 普 通 P C R ( 3 0 c y c l e s ) 在 稀 释 1 2 5 倍 后 呈 勉 强 的 弱 阳 性 ， 二 者 灵 敏 度 至 少 相 差 8 0 倍 。     另 外 一 个 值 得 高 度 注 意 的 是 ： 用 细 胞 培 养 上 清 原 液 进 行 P C R 检 测 居 然 呈 明 显 的 阴 性 ！ 而 原 液 用 水 稀 释 5 倍 后 ， P C R 却 呈 阳 性 。 说 明 ： 细 胞 培 养 上 清 原 液 含 有 强 烈 抑 制 P C R 的 代 谢 物 ！     与 此 形 成 鲜 明 对 比 的 是 ： 采 用 R D R C A 法 的 《 一 步 法 恒 温 支 原 体 检 测 试 剂 盒 》 却 能 在 细 胞 培 养 上 清 原 液 中 检 测 出 支 原 体 污 染 ！ 说 明 ： 同 样 的 代 谢 产 物 虽 然 强 烈 抑 制 P C R 却 不 会 抑 制 R D R C A 的 正 常 扩 增 。     这 是 R D R C A 法 的 巨 大 优 势 ！ 如 此 ， R D R C A 就 不 需 要 进 行 样 品 的 稀 释 或 者 进 行 支 原 体 D N A 的 抽 提 等 的 前 处 理 。 ​ 特 别 提 醒 ：           该 实 验 也 说 明 ： 如 果 使 用 的 P C R 法 支 原 体 检 测 试 剂 盒 没 有 内 参 对 照 ， 而 直 接 使 用 细 胞 培 ​ ​ 养 上 清 原 液 进 行 P C R 检 测 ， 检 测 结 果 即 使 为 阴 性 ， 也 不 能 说 明 其 没 有 支 原 体 污 染 ， 极 有 可 能 是 P C R 的 扩 增 被 细 胞 的 代 谢 产 物 抑 制 了 ！ 这 个 问 题 绝 大 部 分 进 行 支 原 体 检 测 的 人 员 都 不 会 注 意 ， 这 是 利 用 无 内 参 对 照 的 P C R 法 进 行 支 原 体 检 测 的 致 命 弱 点 ! 【 注 ： 由 于 本 公 司 现 在 生 产 的 《 P C R 法 支 原 体 检 测 试 剂 盒 》 （ 货 号 ： P M 0 0 8 ） ， 含 内 参 对 照 ， 已 经 可 以 区 分 真 阴 性 样 品 （ 样 品 无 支 原 体 污 染 。 电 泳 结 果 ： 有 内 参 条 带 ， 无 支 原 体 特 异 条 带 ） 和 假 阴 性 样 品 （ P C R 被 代 谢 产 物 抑 制 。 电 泳 结 果 ： 内 参 条 带 和 支 原 体 特 异 条 带 都 没 有 ） 。 详 情 请 参 考 本 公 司 生 产 的 《 P C R 法 支 原 体 检 测 试 剂 盒 》 说 明 书 】         有 关 P C R 的 扩 增 会 被 细 胞 的 代 谢 产 物 抑 制 的 问 题 ， S i g m a 公 司 的 L o o k O u t M y c o p l a s m a P C R D e t e c t i o n K i t （ 货 号 M P 0 0 3 5 1 k i t ） 的 P C R 法 支 原 体 检 测 试 剂 盒 说 明 书 中 也 特 别 提 到 了 这 点 ， 其 强 烈 建 议 用 试 剂 盒 进 行 D N A 提 取 后 再 进 行 检 测 。 可 见 这 是 利 用 P C R 法 进 行 支 原 体 检 测 过 程 中 普 遍 遇 到 的 问 题 ， 应 该 引 起 科 研 工 作 者 的 高 度 重 视 ！ 否 则 ， 由 此 引 起 的 假 阴 性 （ 培 养 时 间 越 久 ， 概 率 越 高 ） ， 将 使 无 内 参 对 照 的 P C R 法 进 行 的 支 原 体 检 测 变 得 毫 无 意 义 ！ ​   五 、 《 一 步 法 恒 温 支 原 体 检 测 试 剂 盒 》 产 品 形 式     本 公 司 所 有 恒 温 基 因 检 测 产 品 主 要 以 冻 干 品 的 形 式 提 供 （ 如 右 图 所 示 ） 。 《 一 步 法 恒 温 支 原 体 检 测 试 剂 盒 》 同 样 以 冻 干 品 的 形 式 提 供 。 采 用 冻 干 技 术 ， 将 所 有 扩 增 成 分 都 冻 干 在 一 个 0 . 2 m L 的 P C R 管 中 ， 使 用 时 只 需 加 入 水 化 液 和 待 测 样 品 ， 整 个 检 测 过 程 一 步 即 可 完 成 ， 非 常 简 单 。 此 外 ， 由 于 冻 干 品 的 稳 定 性 非 常 好 ， 可 以 在 室 温 保 存 至 少 2 个 月 ， 这 样 非 常 方 便 运 输 和 储 存 ， 也 非 常 适 合 在 野 外 或 者 污 染 点 进 行 即 时 检 测 。 该 工 艺 的 创 新 极 大 的 扩 展 了 相 关 产 品 的 市 场 应 用 前 景 。     六 、 《 一 步 法 恒 温 支 原 体 检 测 试 剂 盒 》 说 明 书 ​ ​ ​ ​ 产 品 重 要 信 息 （ 1 ） 产 品 价 格 ： 《 一 步 法 恒 温 支 原 体 检 测 试 剂 盒 》 （ 货 号 ： M D 0 0 1 ） ； 价 格 ： 8 0 0 元 / 5 0 次 （ 平 均 每 个 样 品 1 6 元 ） 。 （ 2 ） 产 品 说 明 书 ：   P D F 版 说 明 书 ， 请 到 本 公 司 网 站 “ 下 载 中 心 ” 页 面 下 载 ！ （ 冻 干 型 产 品 暂 停 供 应 ） 。 （ 3 ） 方 法 学 报 告 ： 《 一 步 法 恒 温 支 原 体 检 测 试 剂 盒 》 方 法 学 报 告 ， 请 到 本 公 司 网 站 “ 下 载 中 心 ” 页 面 下 载 ！ 细 胞 培 养 专 用 《 一 步 法 恒 温 支 原 体 检 测 试 剂 盒 》 （ 溶 液 型 ） 使 用 说 明 书 （ 版 本 2 0 2 4 0 2 0 6 b ） 【 本 说 明 书 会 不 定 期 更 新 ， 每 次 收 到 新 的 产 品 时 ， 请 到 本 公 司 网 站 重 新 下 载 最 新 版 本 ！ 】 货 号         M D 0 0 1 包 装 规 格         5 0 次 / 盒 储 存 条 件         该 产 品 随 冰 袋 运 输 ， 收 到 产 品 后 请 立 即 放 2 0 ℃ 冰 箱 保 存 ， 该 条 件 下 ， 至 少 3 年 内 仍 然 有 活 性 。 产 品 用 途         《 一 步 恒 温 法 支 原 体 检 测 试 剂 盒 》 （ O n e s t e p Q u i c k c o l o r M y c o p l a s m a D e t e c t i o n K i t ） 主 要 用 于 检 测 细 胞 培 养 液 或 别 的 液 体 样 品 中 是 否 含 有 支 原 体 。 本 产 品 仅 供 科 研 使 用 。 产 品 简 介         哺 乳 动 物 细 胞 的 培 养 ， 支 原 体 （ M y c o p l a s m a ） 污 染 是 个 世 界 性 的 问 题 。 支 原 体 污 染 几 乎 可 以 改 变 细 胞 的 所 有 参 数 ， 导 致 实 验 结 果 的 不 准 确 、 甚 至 完 全 错 误 （ 支 原 体 污 染 对 细 胞 的 详 细 危 害 ， 请 参 考 本 公 司 的 网 站 ： w w w . y i s e m e d . c o m ） 。 从 2 0 1 3 年 开 始 ， 《 N a t u r e 》 期 刊 已 正 式 要 求 投 稿 的 文 章 ， 如 涉 及 细 胞 培 养 都 要 进 行 支 原 体 检 测 。 相 信 会 有 越 来 越 多 的 高 水 平 期 刊 将 做 出 同 样 的 支 原 体 检 测 要 求 。         培 养 法 是 相 对 可 靠 的 支 原 体 检 测 技 术 ， 但 是 该 方 法 非 常 耗 时 的 ， 需 要 数 周 ， 不 适 合 作 为 细 胞 培 养 液 中 支 原 体 污 染 的 快 速 检 测 。 此 外 ， 通 过 固 体 培 养 法 无 法 检 测 污 染 细 胞 的 一 种 最 常 见 的 支 原 体 ， 即 猪 鼻 支 原 体 （ M . H y o r h i n i s ） 。 这 是 因 为 猪 鼻 支 原 体 无 法 在 支 原 体 固 体 培 养 基 上 形 成 可 见 的 菌 落 。 而 猪 鼻 支 原 体 约 占 所 有 支 原 体 污 染 的 2 0 5 0 % 。         有 的 实 验 室 使 用 荧 光 染 色 法 检 测 支 原 体 ， 但 是 该 方 法 灵 敏 度 太 低 ， 而 且 严 重 依 赖 实 验 人 员 的 经 验 ， 实 验 的 稳 定 性 极 差 。 此 外 ， 当 该 方 法 检 测 成 阳 性 时 ， 细 胞 经 常 已 经 严 重 污 染 。         培 养 法 和 荧 光 染 色 法 虽 然 是 我 国 药 典 收 录 的 支 原 体 检 测 方 法 ， 但 是 因 为 其 各 自 都 有 明 显 的 缺 点 ， 不 适 合 作 为 支 原 体 快 速 检 测 的 方 法 。         本 公 司 目 前 已 经 开 发 出 四 种 不 同 原 理 的 快 速 支 原 体 检 测 试 剂 盒 ， 分 别 是 ： 《 一 步 法 恒 温 支 原 体 检 测 试 剂 盒 》 、 《 P C R 法 支 原 体 检 测 试 剂 盒 》 、 《 发 光 法 支 原 体 检 测 试 剂 盒 》 和 《 探 针 法 支 原 体 检 测 试 剂 盒 》 ， 其 各 自 都 有 自 己 的 优 缺 点 （ 详 情 请 参 考 本 公 司 网 站 ） 。         《 一 步 法 恒 温 支 原 体 检 测 试 剂 盒 》 使 用 独 特 的 恒 温 基 因 扩 增 技 术 ， 有 明 显 的 优 点 ： （ 1 ） 整 个 检 测 过 程 只 需 1 小 时 ， 大 大 缩 短 了 检 测 时 间 ； （ 2 ） 未 发 现 细 胞 培 养 液 中 的 P C R 抑 制 剂 会 抑 制 恒 温 基 因 扩 增 ， 所 以 一 般 无 需 进 行 样 品 的 前 处 理 ； （ 3 ） 恒 温 基 因 扩 增 的 灵 敏 度 良 好 ， 一 般 比 3 0 个 循 环 普 通 P C R 法 高 ； （ 4 ） 恒 温 基 因 扩 增 的 产 物 无 需 电 泳 ， 可 以 通 过 指 示 剂 的 颜 色 变 化 直 接 肉 眼 判 断 反 应 结 果 ； （ 5 ） 无 需 用 到 P C R 仪 、 电 泳 槽 、 凝 胶 成 像 仪 等 仪 器 ， 整 个 检 测 过 程 只 需 一 个 水 浴 锅 。         《 一 步 恒 温 法 支 原 体 检 测 试 剂 盒 》 主 要 缺 点 ： （ 1 ） 支 原 体 识 别 率 相 对 较 低 ， 大 约 只 能 识 别 污 染 细 胞 所 有 支 原 体 种 类 的 9 9 % 左 右 ， 还 有 大 约 1 % 的 支 原 体 可 能 无 法 识 别 ， 从 而 导 致 假 阴 性 ； （ 2 ） 高 浓 度 的 血 清 和 相 关 血 液 制 品 、 二 价 离 子 和 E D T A 等 可 能 会 对 显 色 结 果 产 生 干 扰 （ 注 ： 可 以 通 过 离 心 清 洗 去 除 干 扰 ） ， 导 致 结 果 误 判 。         经 测 试 ， 本 试 剂 盒 至 少 可 以 检 测 以 下 1 3 种 支 原 体 ： （ 1 ） M . h y o r h i n i s 、 （ 2 ） M . f e r m e n t a n s 、 （ 3 ） M . a r g i n i n i 、 （ 4 ） M . h o m i n i s 、 （ 5 ） M . o r a l e 、 （ 6 ） M . s a l i v a r i u m 、 （ 7 ） M . p i r u m 、 （ 8 ） A . l a i d l a w i i 、 （ 9 ） M . a g a l a c t i a e 、 （ 1 0 ） M . b o v i s 、 （ 1 1 ） M . b u c c a l e 、 （ 1 2 ） M . a r t h r i t i d i s 、 （ 1 3 ） M . p u l m o n i s （ 注 ： M . 为 M y c o p l a s m a 的 缩 写 ； A . 为 A c h o l e p l a s m a 的 缩 写 ） 。 其 中 ， 前 8 种 为 是 最 常 见 的 污 染 细 胞 的 支 原 体 种 类 ， 约 占 污 染 细 胞 的 支 原 体 的 9 8 % 左 右 。 以 上 1 3 种 约 占 污 染 细 胞 的 支 原 体 种 类 的 9 9 % 左 右 （ 注 ： 目 前 文 献 报 道 ， 体 外 细 胞 支 原 体 污 染 的 种 类 大 概 有 1 9 2 0 种 ， 具 体 支 原 体 种 类 请 看 本 公 司 《 P C R 法 支 原 体 检 测 试 剂 盒 》 说 明 书 ） 。 注 意 ： 本 试 剂 盒 无 法 检 测 U r e a p l a s m a U r e a l y t i c u m 支 原 体 （ 注 ： 该 支 原 体 污 染 细 胞 的 概 率 极 低 ） ！         《 一 步 法 恒 温 支 原 体 检 测 试 剂 盒 》 的 检 测 灵 敏 度 ： 经 测 试 ， 在 每 个 反 应 管 的 D N A 加 入 量 为 2 μ L 的 情 况 下 ， 《 一 步 恒 温 法 支 原 体 检 测 试 剂 盒 》 的 最 高 检 测 灵 敏 度 （ 即 检 测 下 限 ） 大 约 在 2 0 4 0 0 个 c o p i e s ， 即 1 0 2 0 0 c o p i e s / μ L 。 可 以 通 过 离 心 浓 缩 、 提 取 支 原 体 基 因 组 D N A 等 措 施 ， 其 检 测 灵 敏 度 可 以 在 此 基 础 上 继 续 提 高 1 0 1 0 0 倍 。         由 于 任 何 一 种 快 速 支 原 体 检 测 方 法 都 无 法 保 证 检 测 结 果 1 0 0 % 正 确 ， 如 果 您 想 得 到 1 0 0 % 正 确 的 支 原 体 检 测 结 果 （ 比 如 ， 开 展 细 胞 治 疗 的 客 户 ， 进 行 干 细 胞 培 养 的 客 户 ， 生 产 血 清 、 胰 酶 、 培 养 液 的 客 户 ， 出 售 各 种 原 代 培 养 细 胞 系 和 肿 瘤 细 胞 系 的 客 户 等 ） ， 任 选 本 公 司 生 产 的 《 一 步 法 恒 温 支 原 体 检 测 试 剂 盒 》 、 《 P C R 法 支 原 体 检 测 试 剂 盒 》 、 《 发 光 法 支 原 体 检 测 试 剂 盒 》 和 《 探 针 法 支 原 体 检 测 试 剂 盒 》 中 的 两 种 进 行 检 测 ， 将 会 得 到 比 较 满 意 的 结 果 。 如 果 几 种 不 同 支 原 体 检 测 方 法 的 检 测 结 果 一 致 ， 正 确 率 几 乎 就 是 1 0 0 % 。 试 剂 盒 组 成 （ 1 ） 溶 液 1 ： 1 1 5 0 μ L （ 5 0 次 检 测 ） ； （ 2 ） 溶 液 2 ： 5 5 μ L ； （ 3 ） 溶 液 3 ： 指 示 剂 ， 3 8 μ L ； （ 4 ） 阳 性 支 原 体 D N A ： 5 0 μ L 。   需 要 自 己 准 备 的 耗 材 和 试 剂 ： （ 1 ） 0 . 2 m L 透 明 度 良 好 的 平 盖 P C R 管 ； （ 2 ） 2 0 0 μ L 和 1 0 μ L 滤 芯 吸 头 （ 比 如 A x y g e n 公 司 ） 。 以 上 两 种 耗 材 可 以 在 淘 宝 网 购 买 ； （ 3 ） 矿 物 油 ： 由 于 大 部 分 客 户 都 使 用 P C R 仪 进 行 反 应 ， 无 需 使 用 矿 物 油 。 使 用 水 浴 锅 进 行 反 应 的 客 户 ， 请 自 己 购 买 矿 物 油 【 推 荐 ： 从 上 海 生 工 生 物 公 司 购 买 ， 货 号 ： B 5 0 0 3 0 1 0 1 0 0 ， 每 瓶 1 0 0 m L 约 需 5 0 元 ， 每 个 试 剂 盒 大 约 需 要 1 . 5 m L ； 或 者 从 本 公 司 购 买 （ 1 . 5 m L / 支 ） ， 1 0 元 / 支 】 。 检 测 过 程 1 . 待 测 样 品 的 准 备 ：       为 了 准 确 判 断 细 胞 是 否 有 支 原 体 的 污 染 ， 待 测 的 细 胞 培 养 液 样 品 需 要 取 自 换 液 后 培 养 2 3 天 且 汇 合 度 在 9 0 % 左 右 的 细 胞 培 养 液 上 清 （ 贴 壁 细 胞 ） 。 悬 浮 培 养 的 细 胞 也 需 要 在 换 液 传 代 后 ， 让 细 胞 生 长 2 3 天 再 取 培 养 液 进 行 检 测 。 可 以 按 照 以 下 两 种 方 法 之 一 进 行 样 品 的 前 处 理 ： 方 法 一 ： 直 接 检 测 （ 该 方 法 无 法 去 除 可 能 的 干 扰 物 ， 显 色 被 干 扰 的 可 能 性 相 对 较 大 ） ： （ 1 ） 取 1 5 0 μ L 上 述 待 测 样 品 到 1 . 5 m L 离 心 管 内 ， 在 普 通 台 式 离 心 机 上 1 0 0 0 r p m ( 大 约 1 5 0 g ) 低 速 离 心 5 m i n u t e s ， 取 离 心 后 的 上 清 1 0 0 μ L 用 于 支 原 体 检 测 ， 丢 弃 下 层 剩 余 的 5 0 μ L （ 含 细 胞 沉 淀 ） 。 （ 2 ） 已 经 离 心 去 除 细 胞 的 待 测 样 品 可 以 直 接 检 测 ， 也 可 以 进 行 热 处 理 后 再 检 测 （ 热 处 理 后 ， 样 品 保 存 更 稳 定 ） ， 具 体 如 下 ： 9 5 ℃ 加 热 处 理 5 m i n u t e s （ 可 以 转 移 到 P C R 管 内 ， 在 P C R 仪 上 进 行 加 热 处 理 ） ， 简 单 离 心 （ 1 0 0 0 g ， 5 s e c o n d s ） 后 ， 取 上 清 进 行 检 测 。   方 法 二 ： 简 单 离 心 清 洗 （ 推 荐 方 法 。 该 方 法 不 仅 可 以 浓 缩 支 原 体 从 而 提 高 检 测 的 相 对 灵 敏 度 ， 还 可 以 去 除 绝 大 部 分 可 能 的 干 扰 物 ， 显 色 被 干 扰 的 可 能 性 极 小 。 如 果 该 简 单 一 步 离 心 清 洗 的 方 法 仍 然 无 法 去 除 干 扰 物 ， 可 以 使 用 后 文 注 意 事 项 部 分 的 三 步 离 心 清 洗 的 方 法 。 ） ： （ 1 ） 根 据 浓 缩 倍 数 ， 可 以 取 1 0 0 1 5 0 0 μ L 上 述 待 测 样 品 到 1 . 5 m L 离 心 管 内 ， 在 普 通 台 式 离 心 机 上 1 0 0 0 r p m ( 大 约 1 5 0 g ) 低 速 离 心 5 m i n u t e s ， 将 离 心 后 的 上 清 转 移 到 另 一 个 离 心 管 内 ， 丢 弃 细 胞 沉 淀 。 （ 2 ） 将 上 清 继 续 1 3 0 0 0 r p m （ 约 1 6 0 0 0 g ） 高 速 离 心 5 m i n u t e s ， 小 心 吸 走 全 部 上 清 （ 为 避 免 碰 到 底 部 沉 淀 ， 可 以 保 留 底 部 3 5 μ L 液 体 ） ， 用 2 0 5 0 μ L 5 m M T r i s H C l , p H 8 . 0 8 . 8 （ 样 品 可 以 长 期 保 存 。 推 荐 ） 或 者 去 离 子 水 （ 样 品 比 较 不 稳 定 ， 只 适 合 当 天 或 短 期 内 检 测 使 用 ） 重 悬 沉 淀 （ 沉 淀 中 含 有 支 原 体 ） ， 吹 吸 均 匀 【 如 果 最 初 使 用 了 1 5 0 0 μ L 的 样 品 而 最 后 用 2 0 μ L 重 悬 ， 则 支 原 体 浓 度 大 约 提 高 了 7 5 倍 ， 相 对 灵 敏 度 也 提 高 了 7 5 倍 】 。 （ 3 ） 该 重 悬 后 的 样 品 可 以 直 接 检 测 ， 也 可 以 进 行 热 处 理 后 再 检 测 （ 热 处 理 后 ， 样 品 保 存 更 稳 定 ） 。 热 处 理 具 体 如 下 ： 9 5 ℃ 加 热 处 理 5 m i n u t e s （ 可 以 转 移 到 P C R 管 内 ， 在 P C R 仪 上 进 行 加 热 处 理 ） ， 简 单 离 心 （ 1 0 0 0 g ， 5 s e c o n d s ） 后 ， 取 上 清 进 行 检 测 。  注 1 ： 这 里 的 细 胞 培 养 上 清 不 是 指 细 胞 经 胰 酶 消 化 后 的 离 心 上 清 ， 而 是 指 至 少 培 养 2 天 后 的 贴 壁 细 胞 培 养 液 上 清 （ 不 需 要 胰 酶 消 化 ， 也 不 能 取 经 胰 酶 消 化 后 的 离 心 上 清 进 行 检 测 ） 或 悬 浮 细 胞 培 养 液 。  注 2 ： 本 步 骤 的 低 速 离 心 是 为 了 去 除 哺 乳 动 物 细 胞 ， 以 排 除 其 不 必 要 的 干 扰 。 所 以 离 心 力 要 严 格 控 制 在 1 5 0 2 0 0 g ， 该 离 心 力 下 ， 哺 乳 动 物 细 胞 将 被 沉 淀 下 来 而 支 原 体 不 会 。 如 果 错 误 使 用 更 高 的 离 心 力 将 可 能 导 致 支 原 体 也 被 离 心 下 来 ， 从 而 导 致 假 阴 性 。  注 3 ： 收 集 的 待 测 细 胞 培 养 液 样 品 如 果 不 立 即 检 测 ， 请 放 于 2 0 ℃ 或 8 0 ℃ 冰 箱 保 存 ， 不 得 放 于 室 温 或 4 ℃ 冰 箱 。 样 品 在 2 0 ℃ 至 少 可 以 保 存 一 个 月 ， 在 8 0 ℃ 可 以 长 期 保 存 。 此 外 ， 为 了 节 约 检 测 成 本 ， 可 以 将 不 同 时 间 收 集 的 样 品 放 于 2 0 ℃ 或 8 0 ℃ 冰 箱 保 存 ， 而 后 一 起 检 测 。  注 4 ： 如 果 预 期 待 测 样 品 支 原 体 含 量 较 少 （ 比 如 ， 低 温 保 存 的 血 清 、 脐 带 血 、 胰 酶 、 抗 生 素 、 未 使 用 的 培 养 液 、 生 物 制 品 、 极 个 别 细 胞 培 养 上 清 等 ） ， 可 以 采 取 措 施 以 提 高 检 测 的 灵 敏 度 ， 具 体 方 法 请 看 后 文 注 意 事 项 部 分 ： 如 果 提 高 本 试 剂 盒 检 测 灵 敏 度 。 2 . 反 应 体 系 的 配 制 【 本 步 骤 所 有 操 作 强 烈 建 议 使 用 进 口 滤 芯 吸 头 （ 比 如 A x y g e n 滤 芯 吸 头 ） 进 行 操 作 ， 以 避 免 试 剂 被 污 染 。 操 作 之 前 ， 请 认 真 看 完 后 文 的 注 意 事 项 后 ， 再 进 行 操 作 】 ： （ 1 ） 将 溶 液 1 和 溶 液 3 从 2 0 ℃ 冰 箱 中 取 出 ， 室 温 融 化 后 ， 开 盖 之 前 ， 甩 动 溶 液 1 的 离 心 管 将 管 壁 溶 液 甩 到 管 底 ， 而 溶 液 3 必 须 离 心 （ 大 约 3 0 0 0 r p m ， 离 心 1 分 钟 ） 一 下 ， 吹 吸 均 匀 后 【 注 ： 溶 液 1 和 溶 液 3 每 次 融 化 后 都 必 须 吹 吸 均 匀 后 再 吸 取 ， 溶 液 2 和 溶 液 3 开 盖 之 前 ， 请 离 心 一 下 】 ， 按 表 1 进 行 反 应 体 系 的 配 制 ：               具 体 配 置 体 系 ， 请 根 据 P D F 版 说 明 书 进 行 操 作 ！ （ 2 ） 将 上 述 配 制 好 的 恒 温 反 应 体 系 ， 吹 打 均 匀 后 ， 按 每 管 2 4 μ L 分 装 到 0 . 2 m L 的 P C R 管 中 。    注 ： 1 ） 尽 量 保 证 每 管 的 反 应 液 体 积 一 样 。 如 果 分 装 时 最 后 一 管 反 应 液 不 足 ， 可 以 将 其 作 为 阴 性 对 照 管 ； 2 ） P C R 管 应 该 使 用 透 明 度 良 好 的 P C R 管 。 （ 3 ） 阴 性 对 照 管 （ N e g a t i v e ） 可 以 不 加 ， 也 可 以 加 入 1 μ L 灭 菌 水 （ 建 议 不 加 ） ； 往 测 试 管 （ T e s t ） 中 加 入 1 2 μ L 待 测 样 品 （ 前 处 理 使 用 方 法 一 的 ， 建 议 加 1 μ L ； 前 处 理 使 用 方 法 二 的 ， 建 议 加 2 μ L ） ； 往 阳 性 对 照 管 （ P o s i t i v e ） 中 加 入 1 μ L 阳 性 支 原 体 D N A 。 反 应 液 的 总 体 积 为 2 5 μ L 。  注 ： 1 ） 装 有 阳 性 支 原 体 D N A 的 螺 口 管 请 不 要 高 速 离 心 ， 开 盖 之 前 ， 只 要 用 手 指 捏 住 ， 用 力 甩 一 下 即 可 。 吸 取 之 前 ， 请 吹 吸 均 匀 后 再 吸 取 。 如 果 不 小 心 高 速 离 心 了 ， 务 必 吹 吸 均 匀 后 再 吸 取 ， 否 则 阳 性 对 照 结 果 可 能 异 常 。 2 ） 进 行 反 应 体 系 配 制 的 房 间 ， 与 样 品 前 处 理 、 加 阳 性 对 照 D N A 、 样 品 D N A 的 房 间 最 好 分 开 。 3 . 反 应 （ 选 择 以 下 方 式 之 一 进 行 反 应 ） ： （ 1 ） 水 浴 内 反 应 （ 注 意 ： 本 产 品 只 能 使 用 含 水 的 普 通 水 浴 锅 ， 不 能 在 没 有 水 的 纯 金 属 浴 内 反 应 ， 因 为 没 有 水 的 纯 金 属 浴 温 度 非 常 不 准 确 。 ） ： 往 每 个 反 应 管 内 加 入 2 5 μ L 矿 物 油 ， 以 防 止 水 份 挥 发 ， 盖 上 盖 子 ， 将 反 应 管 插 入 带 孔 的 漂 板 内 ， 放 入 已 经 升 温 到 6 1 ℃ 的 普 通 水 浴 内 ， 准 确 反 应 6 0 分 钟 。  注 ： 在 反 应 之 前 ， 水 浴 锅 必 须 先 升 温 到 6 1 ℃ ， 再 放 入 反 应 管 。 此 外 ， 必 须 用 水 银 温 度 计 测 量 水 温 ， 确 保 水 浴 锅 的 温 度 准 确 。 本 试 剂 盒 所 用 的 酶 对 温 度 非 常 敏 感 ， 只 允 许 仪 器 显 示 温 度 与 实 际 温 度 的 温 差 不 超 过 1 ℃ 。 （ 2 ） P C R 仪 上 反 应 ： 有 P C R 仪 的 实 验 室 ， 强 烈 建 议 在 P C R 仪 上 进 行 反 应 ， 这 样 可 以 准 确 控 制 反 应 的 时 间 和 温 度 。 P C R 仪 参 数 如 下 ： 6 1 ℃ ， 6 0 m i n ； 1 0 ℃ , f o r e v e r ； 热 盖 温 度 ， 1 0 5 ℃ 。  注 ： 在 带 热 盖 的 P C R 仪 上 进 行 反 应 ， 无 需 在 反 应 管 内 加 入 矿 物 油 （ 现 在 的 P C R 仪 基 本 都 是 带 热 盖 的 ） 。 4 . 结 果 判 断 ： 6 1 ℃ 反 应 6 0 分 钟 后 ， 立 刻 取 出 反 应 管 ， 放 于 室 温 。 以 一 张 白 纸 或 白 色 泡 沫 盒 （ 优 选 白 色 泡 沫 ） 为 背 景 ， 通 过 反 应 管 溶 液 颜 色 的 变 化 ， 即 可 判 断 检 测 结 果 。 如 果 溶 液 为 蓝 绿 色 ， 则 说 明 有 支 原 体 污 染 ； 如 果 为 紫 红 色 ， 则 说 明 没 有 支 原 体 污 染 （ 如 图 1 ） 。  注 1 ： 在 6 1 ℃ 反 应 的 时 间 必 须 准 确 计 时 ， 超 过 说 明 书 规 定 的 反 应 时 间 可 能 会 出 现 假 阳 性 （ 最 多 不 得 超 过 5 分 钟 ） 。 如 果 试 剂 盒 已 经 过 期 或 者 发 生 其 他 意 外 情 况 影 响 酶 活 性 时 ， 万 一 发 现 ： 6 1 ℃ 反 应 6 0 分 钟 后 ， 阳 性 和 阴 性 颜 色 区 别 不 明 显 ， 可 以 考 虑 将 已 经 反 应 6 0 分 钟 的 反 应 管 ， 继 续 在 6 1 ℃ 的 水 浴 或 P C R 仪 上 反 应 1 0 分 钟 。 但 是 如 果 6 1 ℃ 反 应 6 0 分 钟 后 ， 阳 性 与 阴 性 的 区 别 一 眼 就 可 以 看 出 ， 不 得 继 续 反 应 ， 否 则 可 能 出 现 假 阳 性 。 以 上 只 是 意 外 情 况 下 的 补 救 措 施 。  注 2 ： 如 果 反 应 后 ， 发 现 个 别 样 品 的 颜 色 介 于 阳 性 和 阴 性 之 间 （ 正 常 这 种 情 况 应 该 概 率 很 低 ， 如 果 经 常 出 现 ， 样 品 中 可 能 含 有 可 干 扰 正 常 指 示 效 果 的 物 质 ， 必 须 先 去 除 。 去 除 方 法 见 后 文 注 意 事 项 部 分 ） ， 可 以 将 这 些 样 品 继 续 6 1 ℃ 反 应 1 0 分 钟 。 1 0 分 钟 后 ， 如 果 其 颜 色 仍 然 与 阳 性 对 照 的 颜 色 不 同 ， 该 样 品 应 该 判 为 阴 性 。 这 种 可 疑 样 品 建 议 用 相 同 试 剂 盒 或 者 不 同 原 理 的 其 他 试 剂 盒 （ 如 本 公 司 的 《 P C R 法 支 原 体 检 测 试 剂 盒 》 、 《 发 光 法 支 原 体 检 测 试 剂 盒 》 和 《 探 针 法 支 原 体 检 测 试 剂 盒 》 ） 进 行 复 检 。  注 3 ： 反 应 后 ， 请 勿 打 开 反 应 管 的 盖 子 ， 否 则 有 可 能 造 成 检 测 环 境 的 污 染 。 结 果 判 断 完 后 ， 将 其 用 自 封 袋 密 闭 ， 扔 到 另 外 一 个 房 间 的 垃 圾 桶 内 。  注 4 ： 不 同 批 次 的 产 品 ， 以 及 由 于 拍 照 等 原 因 ， 反 应 后 阳 性 对 照 和 阴 性 对 照 的 颜 色 可 能 会 与 本 说 明 书 书 图 1 的 颜 色 略 有 差 异 （ 比 如 阴 性 对 照 颜 色 可 能 呈 现 浅 红 色 或 紫 红 色 ） 。 只 要 反 应 后 阳 性 对 照 与 阴 性 对 照 的 颜 色 有 显 著 区 别 ， 就 说 明 反 应 成 功 。 ​     图 1 . 左 边 为 阴 性 反 应 结 果 ， 右 边 为 阳 性 反 应 结 果 。 注 意 事 项 1 . 请 确 保 样 品 加 入 后 ， 反 应 之 前 ： 阴 性 、 阳 性 和 所 有 待 测 样 品 的 颜 色 基 本 一 致 。 如 果 个 别 样 品 ， 一 旦 加 入 ， 反 应 管 的 颜 色 就 与 阴 性 、 阳 性 明 显 不 同 ， 说 明 其 中 含 有 可 干 扰 本 系 统 正 常 指 示 效 果 的 物 质 ， 必 须 先 去 除 。 此 现 象 曾 经 在 检 测 C H O 无 血 清 培 养 基 和 一 些 血 液 制 品 （ 比 如 ： 白 蛋 白 溶 液 、 血 浆 原 液 、 血 清 原 液 等 ） 上 发 生 过 。 常 见 的 D M E M 、 M E M 、 F 1 2 、 1 6 4 0 等 培 养 基 （ 可 以 含 1 0 % 血 清 ） 一 般 不 会 发 生 该 现 象 。 去 除 方 法 ： （ 1 ） 离 心 清 洗 ： 取 1 m L 细 胞 上 清 或 待 测 样 品 （ 比 如 ： 白 蛋 白 溶 液 、 血 浆 原 液 、 血 清 原 液 ） ， 先 1 3 0 0 0 r p m 离 心 5 m i n ， 吸 走 9 5 0 μ L 上 清 ； 加 P B S 9 5 0 μ L ， 再 次 离 心 ， 吸 走 9 5 0 μ L 上 清 ； 再 加 P B S 9 5 0 μ L ， 第 三 次 离 心 ， 小 心 吸 走 全 部 上 清 （ 为 避 免 碰 到 底 部 沉 淀 ， 可 以 保 留 底 部 3 5 μ L 液 体 ） ， 用 2 0 5 0 μ L 5 m M T r i s H C l , p H 8 . 0 8 . 8 （ 样 品 可 以 长 期 保 存 。 推 荐 ） 或 者 去 离 子 水 （ 样 品 比 较 不 稳 定 ， 只 适 合 当 天 或 短 期 内 检 测 使 用 ） 重 悬 沉 淀 ， 吹 吸 均 匀 。 该 重 悬 后 的 样 品 可 以 直 接 检 测 ， 也 可 以 进 行 热 处 理 后 再 检 测 （ 热 处 理 后 ， 样 品 保 存 更 稳 定 ） 。 热 处 理 具 体 如 下 ： 9 5 ℃ 加 热 处 理 5 m i n u t e s （ 可 以 转 移 到 P C R 管 内 ， 在 P C R 仪 上 进 行 加 热 处 理 ） ， 简 单 离 心 （ 1 0 0 0 g ， 5 s e c o n d s ） 后 ， 取 上 清 进 行 检 测 。 由 于 离 心 清 洗 可 能 导 致 支 原 体 部 分 丢 失 ， 如 果 样 品 支 原 体 含 量 很 低 ， 可 能 导 致 漏 检 。 （ 2 ） 使 用 本 公 司 《 支 原 体 基 因 组 D N A 提 取 试 剂 盒 》 提 取 支 原 体 D N A 后 进 行 检 测 。 通 过 D N A 提 取 ， 即 可 以 将 所 有 可 能 的 干 扰 物 质 全 部 去 除 ， 又 可 以 将 支 原 体 D N A 浓 缩 1 0 1 0 0 倍 。 2 . 由 于 恒 温 扩 增 所 用 的 各 种 酶 强 烈 依 赖 溶 液 中 的 二 价 离 子 ， 待 测 样 品 的 E D T A 等 金 属 离 子 螯 合 剂 只 能 微 量 存 在 。 如 果 打 算 用 试 剂 盒 提 取 支 原 体 D N A （ 推 荐 使 用 本 公 司 《 支 原 体 基 因 组 D N A 提 取 试 剂 盒 》 ） ， 请 用 去 离 子 水 或 者 不 含 E D T A 的 5 m M T r i s . H C l （ p H 8 . 0 8 . 8 ） 的 缓 冲 液 洗 脱 和 溶 解 D N A 。 3 . 防 D N A 污 染 注 意 事 项 ： （ 1 ） 恒 温 反 应 体 系 配 制 的 房 间 （ 本 试 剂 盒 请 在 有 窗 户 、 通 风 良 好 的 普 通 房 间 操 作 。 请 勿 在 密 闭 的 细 胞 培 养 间 进 行 该 步 骤 的 操 作 ， 因 为 细 胞 培 养 间 支 原 体 污 染 概 率 很 高 ） ， 与 用 于 样 品 前 处 理 、 加 阳 性 对 照 D N A 、 样 品 D N A 的 房 间 一 定 要 分 开 。 （ 2 ） 强 烈 建 议 使 用 滤 芯 吸 头 （ 比 如 A x y g e n 滤 芯 吸 头 ） 吸 取 相 关 溶 液 和 阳 性 支 原 体 等 。 如 果 没 有 滤 芯 吸 头 ， 至 少 应 该 使 用 新 开 封 的 吸 头 。 （ 3 ） 必 须 确 保 使 用 的 移 液 枪 本 身 没 有 残 留 的 支 原 体 。 因 此 ， 最 好 使 用 全 新 购 买 的 移 液 枪 。 如 果 没 有 新 购 买 的 移 液 枪 ， 至 少 应 该 使 用 以 前 没 有 进 行 过 细 胞 培 养 的 移 液 枪 。 因 为 进 行 过 细 胞 培 养 的 移 液 枪 极 有 可 能 被 含 支 原 体 的 培 养 液 污 染 （ 如 细 胞 培 养 时 ， 不 小 心 将 含 支 原 体 污 染 的 培 养 液 吸 入 移 液 枪 的 枪 体 内 ） 。 移 液 枪 中 吸 附 的 支 原 体 有 可 能 造 成 不 必 要 的 假 阳 性 。 （ 4 ） 样 品 前 处 理 的 各 类 吸 头 、 离 心 管 ， 以 及 吸 取 阳 性 对 照 D N A 、 待 测 样 品 D N A 的 吸 头 ， 务 必 小 心 处 理 ， 请 将 其 装 入 含 有 半 瓶 水 的 带 盖 的 、 可 密 封 的 瓶 子 内 ， 全 部 样 品 吸 取 完 后 ， 盖 上 瓶 盖 ， 以 防 止 阳 性 D N A 的 挥 发 ， 造 成 环 境 的 污 染 ， 进 而 造 成 假 阳 性 。 （ 5 ） 整 个 操 作 过 程 ， 最 好 不 要 说 话 ， 因 为 人 的 口 腔 和 唾 液 都 是 带 支 原 体 的 。 （ 6 ） 反 应 后 ， 请 勿 打 开 反 应 管 的 盖 子 ， 否 则 有 可 能 造 成 检 测 环 境 的 污 染 。 结 果 判 断 完 后 ， 将 其 用 自 封 袋 密 闭 ， 扔 到 另 外 一 个 房 间 的 垃 圾 桶 内 。 4 . 本 试 剂 盒 的 检 测 准 确 率 ： （ 1 ） 由 于 本 试 剂 盒 能 识 别 的 支 原 体 大 概 只 占 了 污 染 细 胞 的 支 原 体 的 9 9 % 左 右 ， 还 有 1 % 左 右 的 污 染 细 胞 的 支 原 体 有 可 能 不 认 识 ， 这 可 能 会 导 致 1 % 左 右 的 假 阴 性 （ 漏 检 ） 。 （ 2 ） 由 于 人 体 的 口 腔 、 皮 肤 和 尿 道 都 是 含 有 支 原 体 的 ， 而 且 常 用 的 肿 瘤 细 胞 系 支 原 体 污 染 率 非 常 高 ， 一 般 在 1 5 9 0 % 之 间 ， 导 致 实 验 室 环 境 甚 至 移 液 枪 也 经 常 含 有 支 原 体 ， 这 可 能 导 致 出 现 极 个 别 的 假 阳 性 （ 多 检 ， 正 常 这 种 概 率 应 该 低 于 1 % ） 。 总 体 来 说 ， 单 独 使 用 本 试 剂 盒 有 可 能 出 现 1 2 % 左 右 的 错 误 率 （ 注 意 ： 细 胞 培 养 中 支 原 体 出 现 的 概 率 是 来 自 文 献 数 据 ， 是 大 量 体 外 细 胞 培 养 支 原 体 污 染 调 查 的 结 果 。 如 果 你 们 实 验 室 细 胞 污 染 的 恰 巧 是 出 现 概 率 比 较 低 而 本 试 剂 盒 又 不 认 识 的 支 原 体 ， 漏 检 的 概 率 会 大 幅 度 上 升 。 因 此 ： 对 所 有 重 要 的 样 品 （ 比 如 ， 可 能 用 于 人 体 的 细 胞 ） ， 不 能 只 依 靠 本 试 剂 盒 就 下 最 终 检 测 结 论 ， 必 须 至 少 同 时 使 用 另 外 一 种 支 原 体 识 别 率 为 1 0 0 % 的 支 原 体 检 测 试 剂 盒 【 比 如 本 公 司 《 P C R 法 支 原 体 检 测 试 剂 盒 》 或 《 探 针 法 支 原 体 检 测 试 剂 盒 》 】 进 行 检 测 ， 互 相 验 证 ！ ） 。 为 了 提 高 检 测 的 准 确 率 ， 建 议 客 户 采 取 以 下 两 种 措 施 ： 第 一 ， 对 所 有 本 试 剂 盒 检 测 出 的 阳 性 样 品 ， 利 用 本 试 剂 盒 或 者 其 他 不 同 原 理 的 支 原 体 检 测 试 剂 盒 进 行 复 检 （ 复 检 可 以 基 本 排 除 因 环 境 污 染 导 致 的 假 阳 性 ） ， 或 者 检 测 时 所 有 样 品 直 接 使 用 两 个 反 应 管 同 时 检 测 检 测 ， 只 有 同 一 个 样 品 两 个 反 应 管 的 检 测 结 果 都 为 阳 性 时 ， 才 能 判 断 为 真 正 的 阳 性 样 品 。 第 二 ， 对 所 有 重 要 的 样 品 （ 比 如 ， 可 能 用 于 人 体 的 细 胞 ） ， 必 须 至 少 同 时 使 用 两 种 （ 甚 至 三 种 ） 不 同 原 理 的 支 原 体 检 测 试 剂 盒 （ 其 中 一 种 方 法 推 荐 使 用 支 原 体 识 别 率 为 1 0 0 % 的 《 P C R 法 支 原 体 检 测 试 剂 盒 》 或 《 探 针 法 支 原 体 检 测 试 剂 盒 》 ） 进 行 检 测 ， 互 相 验 证 。 5 . 如 发 现 细 胞 被 支 原 体 污 染 ， 本 公 司 提 供 细 胞 专 用 支 原 体 清 除 和 预 防 试 剂 ， 以 及 水 浴 专 用 杀 菌 剂 和 环 境 专 用 杀 菌 剂 。 6 . 支 原 体 检 测 样 品 可 以 分 成 两 类 ： 第 一 类 ， 用 含 血 清 的 培 养 液 培 养 的 哺 乳 动 物 细 胞 上 清 液 ， 由 于 该 条 件 非 常 适 合 支 原 体 生 长 ， 培 养 数 天 后 ， 支 原 体 密 度 一 般 较 高 ， 可 达 1 0 7 9 / m L ， 可 以 直 接 检 测 。 第 二 类 ， 低 温 保 存 的 血 浆 、 血 清 、 脐 带 血 、 胰 酶 、 抗 生 素 、 未 使 用 的 培 养 液 等 样 品 ， 由 于 这 些 样 品 即 使 有 支 原 体 污 染 ， 支 原 体 含 量 一 般 很 少 ， 直 接 使 用 快 速 支 原 体 检 测 试 剂 盒 进 行 检 测 ， 往 往 检 测 不 出 来 。 这 些 样 品 建 议 ： （ 1 ） 对 样 品 的 支 原 体 进 行 离 心 浓 缩 或 者 使 用 本 公 司 《 支 原 体 基 因 组 D N A 提 取 试 剂 盒 》 将 支 原 体 D N A 浓 缩 提 取 ， 该 两 种 方 法 大 约 可 以 将 检 测 灵 敏 度 继 续 提 高 1 0 1 0 0 倍 。 该 方 法 速 度 快 ， 当 天 出 结 果 ， 但 是 可 靠 性 不 如 后 面 的 培 养 法 。 （ 2 ） 使 用 支 原 体 液 体 培 养 基 （ 必 须 同 时 接 种 不 含 精 氨 酸 和 含 精 氨 酸 的 两 种 支 原 体 液 体 培 养 基 ） 培 养 3 7 天 后 ， 再 进 行 检 测 。 具 体 方 法 请 参 考 本 公 司 《 发 光 法 支 原 体 检 测 试 剂 盒 》 说 明 书 中 最 后 的 注 意 事 项 部 分 。 该 方 法 速 度 较 慢 ， 需 要 3 7 天 ， 但 是 可 靠 性 高 。 7 . 如 何 提 高 本 试 剂 盒 检 测 灵 敏 度 ： 如 果 预 期 待 测 样 品 支 原 体 含 量 较 少 （ 比 如 ， 低 温 保 存 的 血 清 、 脐 带 血 、 胰 酶 、 抗 生 素 、 未 使 用 的 培 养 液 、 生 物 制 品 、 极 个 别 细 胞 培 养 上 清 等 ） ， 可 以 采 取 以 下 几 种 措 施 ： （ 1 ） 通 过 使 用 本 公 司 《 支 原 体 基 因 组 D N A 提 取 试 剂 盒 》 ， 将 支 原 体 D N A 浓 缩 提 取 后 再 进 行 检 测 （ 提 取 过 程 还 可 以 把 所 有 可 能 的 P C R 抑 制 剂 全 部 去 除 ） ， 大 约 可 以 将 检 测 灵 敏 度 提 高 1 0 1 0 0 倍 。 （ 2 ） 对 支 原 体 进 行 离 心 浓 缩 ： 取 1 m L 细 胞 上 清 ， 先 1 3 0 0 0 r p m （ 约 1 6 0 0 0 g ） 离 心 5 m i n u t e s ， 吸 走 全 部 上 清 ， 用 5 0 μ L 5 m M T r i s H C l , p H 8 . 0 8 . 8 重 悬 沉 淀 ， 9 5 ℃ 加 热 处 理 5 m i n u t e s ， 简 单 离 心 后 （ 1 0 0 0 g ， 5 s e c o n d s ） ， 取 上 清 进 行 检 测 。 该 离 心 浓 缩 过 程 大 约 可 以 将 检 测 灵 敏 度 提 高 2 0 倍 。 七 、 《 一 步 法 恒 温 支 原 体 检 测 试 剂 盒 》 第 三 方 学 术 机 构 使 用 后 发 表 的 文 章 八 、 《 一 步 法 恒 温 支 原 体 检 测 试 剂 盒 》 灵 敏 度 测 试         我 们 选 取 了 比 较 有 代 表 性 的 4 种 支 原 体 （ 分 别 是 ： M . h y o r h i n i s ， M . f e r m e n t a n s A . l a i d l a w i i 和 M . p i r u m ） ， 使 用 含 相 应 支 原 体 基 因 片 段 的 质 粒 载 体 ， 经 D N A 定 量 后 ， 计 算 出 相 应 的 分 子 数 。         质 粒 经 4 倍 系 列 稀 释 【 从 4 ^ ( 0 ) 到 4 ^ ( 8 ) 】 ， 进 行 相 应 的 恒 温 扩 增 （ 每 个 反 应 管 的 D N A 加 入 量 为 2 μ L ， 每 个 稀 释 度 做 2 个 重 复 ） ， 并 对 恒 温 扩 增 产 物 进 行 拍 照 。         恒 温 扩 增 反 应 的 结 果 下 图 2 所 示 ：     图 2 . 四 种 支 原 体 质 粒 和 一 种 支 原 体 基 因 组 D N A 经 4 倍 系 列 稀 释 的 恒 温 扩 增 反 应 结 果 。 每 个 稀 释 度 做 2 个 重 复 ， 每 个 反 应 管 的 D N A 加 入 量 为 2 μ L 。 从 结 果 可 知 ： 《 一 步 恒 温 法 支 原 体 检 测 试 剂 盒 》 的 检 测 下 限 范 围 较 宽 ， 对 于 不 同 的 支 原 体 检 测 下 限 有 较 大 区 别 ， 从 最 低 的 大 约 2 0 c o p i e s 【 即 大 约 1 0 c o p i e s / μ L 】 （ 图 1 A 和 1 B ） 到 大 约 1 2 0 4 0 0 c o p i e s 【 即 大 约 6 0 2 0 0 c o p i e s / μ L 】 （ 图 1 C 1 D ） 。 可 能 的 原 因 是 ： （ 1 ） 恒 温 扩 增 需 要 多 条 引 物 同 时 起 作 用 ， 而 每 种 支 原 体 的 核 酸 序 列 会 有 所 不 同 ， 导 致 不 同 支 原 体 的 扩 增 效 率 有 一 定 区 别 ； （ 2 ） 本 试 剂 盒 使 用 了 多 套 不 同 的 引 物 ， 每 套 引 物 的 扩 增 效 率 也 会 有 所 区 别 。 我 们 正 在 评 估 是 否 需 要 对 其 中 扩 增 效 率 较 低 的 引 物 组 进 行 优 化 升 级 。 如 果 有 优 化 升 级 ， 后 续 产 品 说 明 书 和 方 法 学 报 告 中 会 有 明 确 说 明 。     注 ： 《 一 步 恒 温 法 支 原 体 检 测 试 剂 盒 》 检 测 灵 敏 度 详 细 数 据 ， 请 参 考 其 方 法 学 报 告 。 九 、 祝 贺 上 海 易 色 医 疗 的 支 原 体 检 测 试 剂 盒 2 0 2 4 年 先 后 登 上 中 科 院 S C I 一 区 杂 志 ， 影 响 因 子 分 别 超 6 . 0 和 8 . 0 ！ 上 海 易 色 医 疗 科 技 有 限 公 司       联 系 方 式 （ 1 ） 微 信 : 2 7 4 3 7 5 2 1 2 9 （ 7 X 2 4 小 时 在 线 ） ； （ 2 ） 1 7 8 1 1 8 6 6 3 0 8 （ 8 : 0 0 1 8 : 0 0 ） ; （ 3 ） 邮 箱 ： y i s e m e d @ 1 6 3 . c o m 产 品 购 买 ， 请 通 过 微 信 （ 首 选 ） 、 电 话 或 者 邮 箱 等 方 式 提 供 以 下 信 息 ： （ 1 ） 买 方 发 票 抬 头 、 单 位 税 号 、 快 递 地 址 、 联 系 人 、 电 话 、 电 子 邮 箱 和 负 责 人 姓 名 ； （ 2 ） 购 买 产 品 的 名 称 、 货 号 和 数 量 ； （ 3 ） 默 认 随 货 只 提 供 发 票 ， 如 果 需 要 我 们 提 供 别 的 材 料 【 如 发 货 单 、 纸 质 合 同 等 】 ， 请 注 明 。 （ 4 ） 室 温 和 冰 袋 运 输 产 品 ， 每 单 收 取 2 5 元 运 费 ； 干 冰 运 输 产 品 ， 每 单 收 取 1 5 0 元 运 费 。 （ 5 ） 用 易 色 产 品 ， 赢 奖 金 活 动 【 详 情 请 见 本 网 站 下 载 中 心 页 面 】 ！ 沪 I C P 备 1 4 0 3 4 3 2 2 号 1 友 情 链 接 百 度 丁 香 园   丁 香 通   小 木 虫 生 物 在 线 首 页       公 司 简 介     上 市 产 品       产 品 价 格       下 载 中 心 （ P D F 版 说 明 书 ）       联 系 我 们   【 以 下 为 产 品 快 速 导 航 】 1 、 支 原 体 相 关 产 品 ： 四 款 《 支 原 体 检 测 试 剂 盒 》 选 购 指 南 、 《 一 步 法 恒 温 支 原 体 检 测 试 剂 盒 》 、 《 P C R 法 支 原 体 检 测 试 剂 盒 》 、                                     《 发 光 法 支 原 体 检 测 试 剂 盒 》 、 《 探 针 法 支 原 体 检 测 试 剂 盒 》 、 《 发 光 法 阳 性 对 照 》 、 《 支 原 体 清 除 和 预 防 》 、                                     《 水 浴 专 用 杀 菌 剂 》 和 《 环 境 专 用 杀 菌 剂 》 、 《 支 原 体 液 体 培 养 基 ， 不 含 精 氨 酸 和 含 精 氨 酸 两 种 》                                   《 支 原 体 基 因 组 D N A 提 取 试 剂 盒 》 （ 离 心 柱 法 ） 、 《 猪 鼻 支 原 体 活 菌 种 》 、 《 口 腔 支 原 体 活 菌 种 》 2 、 蛋 白 质 相 关 产 品 ： 《 双 色 预 染 M a r k e r 和 自 发 光 M a r k e r 套 装 》 、 《 双 色 预 染 M a r k e r 》 、 《 W e s t e r n B l o t 专 用 自 发 光 M a r k e r 》 、                       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